Description

La protéine archaerhodopsin-3 (AR-3), une pompe à protons photo-activable issue d'Halorubrum sodomense, est à l’origine de toute une classe d'indicateurs de tension membranaire, génétiquement modifiés pour être fluorescents (GEVI). Comme dans d'autres rhodopsines microbiennes, l'absorption de la lumière visible déclenche dans AR-3 la photoisomérisation réversible de son chromophore appelé rétinal, qui conduit à l'apparition de plusieurs intermédiaires avec une durée de vie couvrant une échelle de temps de la sub-picoseconde à la milliseconde. Les applications en microscopie neuronale basées sur l'AR-3 sont variées, grâce à d'importantes modifications génétiques et au criblage des meilleurs GEVIs. Mais leur champ d'application reste limité, entravé par leur luminosité de fluorescence plutôt faible par rapport aux protéines fluorescentes (FP). Parallèlement à l'approche de sélection génétique, le détail des mécanismes de fluorescence moléculaire des archaerhodopsines n’est pas suffisamment connu pour permettre l’utilisation efficace d’une approche rationnelle visant à améliorer leurs propriétés de fluorescence. À la différence des autres rhodopsines et protéines dont la fluorescence est initiée par 1 photon, la fluorescence de l’AR-3 naturelle nécessite l'absorption de 3 photons. L'état fluorescent est produit à un stade tardif du photo-cycle de AR-3 (> 1 ms) à partir d'un intermédiaire dans l'état fondamental obtenu après l’isomérisation du rétinal à l'état excité (~ 1 ps), rendant ainsi sa caractérisation structurale ou spectroscopique très difficile. Aujourd’hui encore, une compréhension détaillée de ce mécanisme manque. Ce défi sera relevé dans le cadre du projet de recherche UltrArchae en appliquant des méthodes avancées de spectroscopies électroniques et vibrationnelles ultrarapides et des méthodes de chimie quantique de pointe, soutenues par la cristallographie aux rayons X résolue temporellement. Celles-ci seront appliquées pour caractériser les différents intermédiaires transitoires caractérisant la majeure partie du photo-cycle d’AR-3. Ces méthodes, en particulier un nouveau schéma d'excitation avec trois impulsions laser ultra-courtes précisément chronométrées et un nouveau modèle QM/MM basé sur une extension de la théorie de la fonctionnelle de la densité dépendante du temps récemment développée, permettront d'obtenir des informations détaillées sur la dynamique structurelle et sur le profil énergétique dans l'état excité des états conformationnels métastables et fluorescents clés («intermédiaires») caractérisant AR-3 et certains de ses mutants. En particulier, des mutations ponctuelles sur des positions spécifiques (accepteurs de proton, poche de liaison du rétinal) permettront de comprendre quelles sont les étapes du photocycle d’AR-3 les plus affectées : photoisomérisation initiale plus performante augmentant la concentration des intermédiaires, modification de la durée de vie de l'intermédiaire fluorescent basée sur l'interaction de la cage protéique avec le chromophore ou sur la modification de l'équilibre chimique entre ces intermédiaires, ou activation / désactivation de canaux spécifiques de désexcitation de l'état intermédiaire fluorescent par mutation de résidus. UltrArchae est un projet inter-disciplinaire qui rassemble des physiciens, des physico-chimistes expérimentaux et théoriques ainsi que des biologistes structurelles de France (Aix-Marseille, Lille et Strasbourg) et du Royaume Uni. Le projet fournira pour la première fois une compréhension mécanistique détaillée des relations structure-fonction à l’origine des propriétés de fluorescence inhabituelles de AR-3 et de ses variants. Nous prévoyons que ces résultats seront d'une importance cruciale dans la poursuite de l'amélioration des capteurs fluorescents basés sur les protéines incorporant le chromophore rétinal.

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